Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒是一种基于四氮唑盐-8 (WST-8)测定法的试剂盒。WST-8测定法是一种优化的比色法，根据细胞氧化还原电位评估哺乳动物细胞的细胞活力、增殖和细胞毒性。活细胞代谢中的脱氢酶在电子载体(1‐甲氧基‐5‐甲基吩嗪甲基硫酸酯)存在下将四氮唑盐WST‐8还原为橙黄色甲臜染料（formazan），在450 nm处具有最大光吸收。由于这种反应发生在代谢活跃的细胞中，因此它被认为是细胞活力的指标。颜色深浅（产生的甲臜量）与样品中活细胞的数量呈线性关系。

操作方法

本试剂盒可用于细胞活力、增殖和细胞毒性的检测。

1）制作标准曲线

a.用细胞计数板计数细胞悬液中细胞的数量，然后将细胞接种到96孔板中；

b.按比例依次用培养基等比稀释，一般要做5-7个细胞浓度梯度，每个浓度建议4-6个复孔；

c.接种培养4小时后细胞贴壁，然后每孔100 μL的细胞培养基中加入10 μL CCK-8试剂，轻轻晃动平板，使生成的染料均匀分布在孔中；

d.在37°C的CO2培养箱中孵育，孵育时间从30分钟到4小时不等，具体取决于所使用的细胞类型和细胞浓度。450 nm处 (430 - 490 nm)测定OD值，最终制作一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验条件完全一致）

2）细胞增殖和细胞毒性试验

a.实验前确定特定细胞的最佳细胞数和孵育时间；

b.于96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，在37°C的CO2培养箱中培养细胞24小时，（毒性试验需要在培养板加入不同浓度的待测药物，孵育一段时间）；

*如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

c.每孔加入10 μL CCK8试剂（不要产生气泡），轻轻晃动平板，使染料均匀分布在孔中，在细胞培养箱中孵育时间从30分钟到4小时不等；

d.酶标仪测定在 450 nm(430 - 490 nm)处的吸光度；

e.计算细胞的存活率或抑制率

细胞存活率%=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100%

抑制率%=[A(0加药)- A(加药)]/ [A(0加药)- A(空白)]×100%

A(加药): 具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液孔的吸光度

A(空白): 具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞孔的吸光度

A(0加药): 具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液孔的吸光度

细胞存活率%和抑制率%一定程度上显示了细胞增殖活力或细胞毒性。

1) 使用本产品之前，请仔细阅读本说明书，穿戴实验服和一次性手套；

2) 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品；

3) 建议采用多通道移液器，减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，避免气泡产生，会干扰OD值读数；

4) 反应体系中若存在还原剂 (例如一些抗氧化剂) 会干扰检测，需更换新鲜培养基再进行实验检测；

5) 96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意边缘试剂蒸发问题，以免影响实验结果；

6) 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响；

7) 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。

8) 不同批次的试剂不得混用或超过有效期使用，避免重复冻融循环。