AmBeed文献解读|Nature Chemistry

具有短波红外吸收和发射特性的硅-RosIndolizine荧光团可实现体内荧光成像

      2024年3月25日，美国加州大学Ellen M. Sletten课题组和密西西比大学Jared H. Delcamp课题组在Nature Chemistry上发表《Silicon-RosIndolizine fluorophores with shortwave infrared absorption and emission profiles enable in vivo fluorescence imaging》。

      研究背景
      生物医学成像使生物内部结构可视化，是科研人员和医疗人员的宝贵工具，有助于医疗人员诊断疾病和损伤，并提供身体区域的空间信息。短波红外（shortwave infrared，SWIR，1000-1700nm；有时也称为第二和第三近红外区域）和扩展短波红外（extended SWIR, ESWIR, 1700-2700nm）区域的体内荧光成像在诊断成像方面具有巨大的潜力。短波红外荧光成像可以避免有害的电离辐射，可以提供高时空分辨率，能够对特定疾病/区域进行靶向成像并提供快速的数据采集。虽然图像对比度随着波长的增加而提高，但在这些区域发射的有机荧光团的设计和合成具有挑战性。与可见光相比，SWIR 和ESWIR区域的光通过限制光散射、吸收和生物组织的自发荧光，为全身体内成像提供了多种优势。这些因素会阻碍激发光穿透和所获图像的对比度。虽然PbS量子点和铈基材料的峰值发射波长超过1400nm，但这些材料有毒，不适合体内应用。尽管有机小分子荧光团具有提高图像质量的巨大潜力，但尚无峰值发射波长超过1400nm的有机小分子荧光团。目前有大量有机荧光团在近红外 (700-1000nm) 波段吸收和发射，但仍然只有少数有机荧光团在短波红外(SWIR)波段吸收和发射。这些SWIR有机荧光团迄今为止提供了最高分辨率的体内荧光图像。
      最近，研究人员通过吲哚嗪杂环代替烷基胺供体，合成了一种SWIR峰值发射型呫吨基荧光团，材料吸光度红移约400nm至930nm，SWIR发射最大值为1092nm。此后不久，对位官能团化的苯乙烯基供体被用于在1210nm处具有极低能量发射最大值的荧光团。通过将荧光团封装在胶束中，可产生快速、高分辨率的体内SWIR血管荧光图像。之后，又发现了一种1256 nm发射荧光团，该荧光团是通过在杂环外围添加N,N-二甲基苯胺 (DMA)基团来调节吲哚嗪供体基团而实现的。已知用硅取代氧来修饰呫吨会导致峰值发射波长红移约90 nm (图 1)。

图1. 呫吨和硅取代呫吨基荧光团的发射最大值。文献中带有烷基胺供体的呫吨和硅取代呫吨荧光团的结构（左上框）、文献中带有杂环供体的呫吨荧光团的结构（右上框）以及本文介绍的SiRos荧光团（下框）。箭头表示各自的发射最大值。迄今为止报道的最长波长发射最大值在标尺上显示为红色菱形。

研究内容

作者首先合成了硅取代的呫吨与DMA修饰的吲哚嗪供体的荧光团（SiRos），然后研究了SiRos荧光团的光物理特性，检测了SiRos荧光团的光致发光寿命，进行了几何优化和瞬态密度泛函理论计算，研究了SiRos荧光团在多种亲核试剂中的稳定性，进行了体内成像实验。

SiRos荧光团的合成始于脱氧反应，随后是硅烷化环化反应，然后氧化，得到硅取代的化合物3。然后使用钯催化来连接相应的吲哚嗪供体。格氏反应后进行酸性处理，得到最终的SiRos荧光团。含有DMA基团的SiRos需要在无水碱的基础上进一步处理。

图2. SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的合成路线。

吸收光谱显示，在CH₂Cl₂中，SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700分别在1140 nm、1348 nm、1440 nm处的峰值能量较低。SiRos1700与SiRos1300、SiRos1550相比，吸收曲线更宽。SiRos1550在CH₂Cl₂中的摩尔吸光系数 (ε)最大，为122000 M^–1cm^–1，而SiRos1300和SiRos1700分别为115000 M^–1cm^–1和98000 M^–1cm^–1（表1）。此外，作者还研究了SiRos荧光团在CH₃CN中的吸收，以了解溶剂极性增加对染料的光物理性质的影响（表1）。CH₃CN中，SiRos荧光团吸收曲线变宽并向更高的能量转变，ε下降到CH₂Cl₂中的一半以上。较低的摩尔吸收率、向较高能量的转变和吸收曲线变宽表明，随着溶剂极性的增加，SiRos荧光团可能开始从 π → π* 体系转变为 n → π* 电荷转移体系。在胶束-D₂O环境中扩大吸收和吸收变宽可能由于聚集体形成或溶剂极性增加。在CH₂Cl₂中测量了SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的发射光谱和荧光量子产率（ΦF）（图3、表1）。SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的染料峰值发射波长（λ_emis ^max）分别为1300nm、1557nm、~1700nm。所有染料的发射起始波长（λ_emis ^onset）都在ESWIR区域内：SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700分别为1800 nm、2000 nm、2200 nm，截至文献发表，有机小分子的λ_emis ^max在1380nm，SiRos1550和SiRos1700分别超过~170nm和~320nm。在D₂O中，SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的λ_emis ^max为1241 nm、1475 nm和1500 nm。在CH₂Cl₂中，SiRos1550的ΦF为0.0025±0.0003%，约为SiRos1300的一半，而SiRos1700的ΦF为0.0011±0.0003%，约为SiRos1550的一半。在胶束内，SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的ΦF值分别为0.0068±0.0009%、0.0021±0.0003%、0.0007±0.0001%。在CH₂Cl₂中，SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的分子亮度值（Molecular brightness）分别为6.4 M^–1cm^–1、3.1 M^–1cm^–1和1.1 M^–1cm^–1（表1）。

在785 nm激光激发下，使用量子效率>30%、仪器响应低于100 ps的超导纳米线单光子探测器（对800-2500 nm的光敏感）检测并计时发射的光子。寿命与荧光团的发射能量成反比，其中SiRos1300具有最短的解卷积寿命 20ps，而SiRos1700 具有最长的寿命47ps。斯托克斯位移（EStokes）没有变化趋势，表明与发色团之间的振动模式有类似的耦合。众所周知，溶剂重吸收会缩短荧光寿命，能量会从发色团直接转移到溶剂。因此，考虑到这些因素，较长波长下的荧光寿命延长就更加惊人。

图3. 在1×10^-5M CH₂Cl₂溶液中SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的摩尔吸收光谱（左）和归一化发射光谱（右）。

表1. SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700在指定溶剂中的光物理特性

表2. SiRos 荧光团的光致发光寿命、斯托克斯位移、吸收和发射振子强度、跃迁偶极矩和简并比

使用 Gaussian 软件上对SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700进行了含时密度泛函理论计算。计算预测的垂直跃迁能量趋势与CH₂Cl₂中实验的λ_abs ^max趋势一致，即SiRos1300。

图4. SiRos荧光团的前线(分子)轨道理论分析。

在CH₃CN溶液中测定了SiRos1300在各种亲核试剂条件下的稳定性，固定时间间隔测量SiRos1300的剩余吸收。存在小的阴离子亲核试剂（SiRos1300浓度的10倍）的情况下，SiRos1300的吸收迅速衰减，测量之前荧光团吸收信号完全丢失，这些亲核试剂包括OH⁻、F⁻和CN⁻。在10% H₂O/CH₃CN溶液中，SiRos1300在一周内维持了约85%的初始吸收量，表明了与中性亲核试剂相比，阴离子亲核试剂促进荧光团吸收信号更快地衰减。

作者对以菜籽油为基础的纳米乳液进行了研究，以实现长时间的体内成像。纳米乳液是使用Pluronic F-68表面活性剂在磷酸盐缓冲液中乳化菜籽油制成（图5a）。负载SiRos1300和SiRos1550的纳米乳液的吸收光谱显示出与有机溶剂中染料吸收非常相似的特征（图3），表明纳米乳液中荧光团的单分子行为（图5b，顶部）。SiRos1300纳米乳液的粒径平均尺寸为260nm，多分散指数为0.44，而SiRos1550纳米乳液的粒径平均尺寸为194nm，多分散指数为0.27。在相同的成像条件下，SiRos1300纳米乳液的亮度大约是SiRos1550纳米乳液的两倍（图5b，底部）。SiRos1300和SiRos1550 纳米乳液都表现出优异的空间分辨率（图5c，d）。

图5. SiRos 纳米乳剂的制备及通过静脉注射进行体内可视化。

结论

作者合成了一系列硅-RosIndolizine (SiRos) 荧光团，其峰值发射波长为1300–1700 nm，发射起始波长为1800–2200 nm。SiRos1300、SiRos1550、SiRos1700的峰值发射波长为1300 nm、1557nm和1700 nm，荧光量子产率分别为0.0056%、0.0025%、0.0011%（均在CH₂Cl₂中）。

利用含时密度泛函理论，以光物理（稳态和时间分辨）、电化学和计算的方式对荧光团进行表征。SiRos荧光团的光致发光寿命在皮秒范围内，寿命和发射能量成反比，其中SiRos1700>SiRos1550>SiRos1300。光致发光寿命趋势归因于随着荧光基团的光学间隙减小，单重态和三重态激发态的潜在混合。当从非极性非质子溶剂（CH₂Cl₂）切换到极性非质子溶剂（CH₃CN）时，随着吸收宽度的扩大和摩尔吸收率的降低，实验观察到了部分电荷转移行为。

两种荧光团（SiRos1300 和 SiRos1550）以菜籽油为基础，配制纳米乳液，并将其用于小鼠心血管系统的全身循环短波红外荧光成像。实验得到了高分辨率短波红外图像，整个循环系统的血管清晰可见，尤其在股动脉、腹腔和颈静脉。

SiRos 骨架确立了产生长波长发射SWIR和ESWIR荧光团的设计原则。未来的研究方向是设计水溶性荧光团和ESWIR区域量子产率更高的荧光团。

DOI: http://10.1038/s41557-024-01464-6