AmBeed文献解读|Nature Microbiology

通过化学水解和工程化恶臭假单胞菌对聚酰胺进行升级再利用

2025年2月10日，德国于利希研究中心Nick Wierckx研究团队发表名为《Upcycling of polyamides through chemical hydrolysis and engineered Pseudomonas putida》的研究。此研究主要是通过化学水解和工程化微生物（Pseudomonas putida）来回收和升级聚酰胺（尼龙）。研究人员通过实验室适应性进化和代谢工程，改造了Pseudomonas putida KT2440菌株，使其能够代谢尼龙单体（如6-氨基己酸、ε-己内酰胺和1,6-己二胺）以及尼龙低聚物。通过RNA测序和基因编辑，研究人员揭示了尼龙单体代谢的途径，并成功将尼龙水解产物转化为高附加值的生物塑料——聚羟基丁酸酯（PHB）。这项研究不仅为尼龙的可持续回收提供了一种新的解决方案，还展示了PA6水解产物作为生物技术原料的潜力，为塑料废物的生物升级回收开辟了新的道路。

研究背景

全球塑料生产量不断增加，2022年已达到约4亿吨，其中聚酰胺（尼龙）由于其高耐久性和抗拉强度被广泛应用于纺织和汽车行业。然而，尼龙的回收率极低（<2%），大多数尼龙材料被填埋或焚烧，这不仅造成了资源浪费，还带来了生态风险。传统的化学回收方法需要高纯度的原料，并且会产生多种单体和低聚物的混合物，增加了下游纯化的难度。因此，开发可持续的尼龙回收解决方案迫在眉睫。

研究方法

1. 微生物工程：研究人员通过实验室适应性进化（Adaptive Laboratory Evolution, ALE）和代谢工程，改造了Pseudomonas putida KT2440菌株，使其能够代谢尼龙单体（如6-氨基己酸、ε-己内酰胺和1,6-己二胺）以及尼龙低聚物。

2. 基因编辑和转录组分析：利用CRISPR/nCas9辅助的多重胞嘧啶碱基编辑技术，研究人员对P. putida的基因进行了编辑，以增强其代谢能力。通过RNA测序（RNA-seq）技术，研究人员分析了改造菌株在代谢尼龙单体时的基因表达变化，揭示了代谢途径。

3. 化学水解与微生物转化结合：研究人员将化学水解（将尼龙聚合物分解为单体和低聚物）与微生物转化相结合，利用改造后的P. putida将尼龙水解产物转化为高附加值的生物塑料——聚羟基丁酸酯（PHB）。

4. 代谢途径的解析和优化：通过基因敲除、酶活性测定和代谢途径分析，研究人员进一步优化了P. putida的代谢途径，使其能够更高效地利用尼龙单体和低聚物。

AmBeed产品

Ahx2（6-(6-Aminohexanamido)hexanoic acid）：货号A123680

Ahx3（6-(6-(6-Aminohexanamido)hexanamido)hexanoic acid）：货号A186461

产品在本研究中的作用：

1. 作为尼龙6（PA6）水解产物的模型底物：Ahx2 和 Ahx3 是PA6在化学水解过程中产生的典型低聚物。通过研究Pseudomonas putida对这些低聚物的代谢能力，可以评估微生物对PA6水解产物的利用效率。

2. 验证Pseudomonas putida的代谢能力：研究团队通过适应性实验室进化（ALE）和代谢工程，使Pseudomonas putida能够代谢Ahx2和Ahx3。这些低聚物的代谢能力是评估工程菌株性能的关键指标之一。

3. 揭示代谢途径和关键基因：通过研究Ahx2和Ahx3的代谢，研究团队揭示了Pseudomonas putida中与尼龙低聚物代谢相关的代谢途径和关键基因。例如PP_0411-4 编码的多胺ABC转运蛋白在Ahx2和Ahx3的摄取中起关键作用。nylB 基因编码的Ahx低聚物外切酶能够逐步释放Ahx单元，从而将Ahx2和Ahx3代谢为Ahx。

 

图1. 工程化改造假单胞菌在C6-PA单体上的生长 

通过基因组测序和反向基因组学，研究人员鉴定并验证了关键突变（PP_2884基因的9-bp缺失、PP_0409基因的W676L点突变），最终构建出能够高效代谢这些单体的工程菌株P. putida NYL，为尼龙水解产物的微生物升级回收提供了基础。

 

图2. 工程化P. putida中C6-PA单体的代谢 

通过RNA测序（RNA-seq）分析，研究团队揭示了菌株在代谢6-氨基己酸（Ahx）、ε-己内酰胺（ε-caprolactam）和1,6-己二胺（HMDA）时的基因表达变化，确定了参与这些代谢过程的关键酶和转运蛋白。特别是，PP_0411-4编码的多胺ABC转运蛋白被显著上调，表明其在单体和低聚物摄取中的关键作用。此外，研究还发现了PP_2884和PP_0409-10这两个转录调控因子的突变，这些突变通过影响下游基因的表达，增强了菌株对C6-PA单体的代谢能力。

 

图3. 工程化假单胞菌属（Pseudomonas putida）菌株对线性Ahx寡聚体的代谢 

研究团队通过适应性实验室进化（ALE）和代谢工程，引入了关键突变PP_0412V222L和CbrAA625T，显著提高了菌株对这些低聚物的代谢效率。实验结果表明，经过改造的Pseudomonas putida NYLON-B菌株能够在含有Ahx2和Ahx3的培养基中快速生长，并且能够完全代谢这些低聚物。此外，该菌株还能有效利用从PA6水解得到的可溶性低聚物混合物，进一步证明了其在PA6回收和微生物上循环中的潜力。

 

图4. 环状Ahx低聚物的代谢

图4主要展示了工程化Pseudomonas putida菌株对环状尼龙低聚物（cyclic Ahx2–6）的代谢能力。通过表达不同的尼龙酶（NylA、NylB、NylC）组合，研究发现菌株能够代谢环状Ahx2，但对更大的环状低聚物（Ahx3–6）代谢能力有限。这表明NylC的活性不足可能是限制因素。

 

图5. 微生物将PA材料升级转化为聚羟基丁酸酯 

研究人员通过酸水解PA6获得含有Ahx和线性Ahx低聚物的水解产物，作为唯一碳源，P. putida NYLON-PHB在48小时内完全代谢这些低聚物，最终细胞中的PHB含量达到7.0%（占细胞干重的比例），与使用纯Ahx作为底物时的产量相当。

 

图6. 利用工程化假单胞菌 P. putida NYLON 衍生物从 PA 水解物中生产氨基酸衍生的次级代谢产物 

研究团队通过在P. putida NYLON-ABC中引入相应的生物合成途径，成功实现了这些高附加值化合物的生产。实验结果表明，使用PA6水解产物作为碳源，P. putida NYLON-VIO能够生产紫青素，而P. putida NYLON-SWR能够生产serrawettin W1。这些结果证明了PA6水解产物作为生物技术原料的通用性，进一步突显了微生物上循环在可持续塑料废弃物处理中的潜力。

关键结论

微生物宿主的开发：研究团队成功开发了P. putida NYLON-ABC，这是一种能够代谢尼龙单体和低聚物的工程菌株。

代谢途径的揭示：通过RNA-seq分析，研究团队揭示了尼龙单体代谢的代谢途径，包括转录调控因子和转运蛋白。

微生物上循环的实现：P. putida NYLON-PHB能够将尼龙水解产物转化为PHB，为尼龙的可持续回收提供了一种新的方法。

Doi: 10.1038/s41564-025-01929-5