AmBeed文献解读|Biomacromolecules

具有独特自组装、吸收和降解特性的生物相容性糖聚合物-PLA 两亲性杂化嵌段共聚物

2024年9月14日，俄亥俄州立大学Davita L. Watkins课题组和南密西西比大学Sarah E. Morgan在Biomacromolecules（IF=5.5）发表《Biocompatible Glycopolymer-PLA Amphiphilic Hybrid Block Copolymers with Unique Self-Assembly, Uptake, and Degradation Properties》一文。这项工作强调了聚合物设计在纳米医学中的重要性，为两亲性杂化嵌段共聚物的结构-性能关系及其作为生物相容性运载载体用于药物和染料递送提供了见解，有望推进非侵入性生物成像技术并改善疾病诊断和治疗。

研究背景

聚合物纳米粒子（PNs）通过聚酯、聚烷基氰基丙烯酸酯或两亲性嵌段共聚物等聚合物的自组装形成，已成为一种有前途的治疗递送方法。两亲性杂化嵌段共聚物（HBCs）是一类独特的两亲性、支链、不对称大分子结构，类似于 Janus 树枝状聚合物（JDs），能够根据其结构单元和成分自组装成各种纳米结构，包括胶束和双层囊泡。这些纳米结构受益于树枝状聚合物支链结构，可通过三种不同的机制包封药物：（1）包封在空隙空间内，具体取决于药物的大小；（2）药物与树枝状聚合物分支点的二次或静电键合；（3）如果药物和树枝状聚合物带相反电荷，则在树枝状聚合物表面发生电荷-电荷相互作用。JDs 依靠阳离子部分来进行细胞转染，但是，当浓度和聚合物聚合度较高时，阳离子部分会产生毒性。可用聚乙二醇（PEG）作为亲水嵌段来降低毒性。然而，PEG 及其衍生物与患者敏感性有关，并且可能会抑制细胞内化。已有文献报道，在树枝状聚合物表面加入糖结构来降低 JDs 细胞毒性并增强树枝状聚合物的性能，丰富的自由表面糖为受体蛋白提供了大量的附着位点，亲水性和生物活性增强，纳米粒子细胞毒性降低。

糖聚合物具有生物相容性、低细胞毒性、高亲水性和细胞识别能力，是传统亲水嵌段的有前途的替代品，可根据特定需求进行定制。与天然多糖相比，带有侧链的合成糖聚合物具有更多的游离羟基。合成糖聚合物中游离羟基的丰富性增强了水溶性，增加了它们在溶液中聚集以及与其它分子结合的倾向。虽然糖修饰在树枝状聚合物表面并不少见，但糖聚合物作为两亲性共聚物的亲水嵌段还未得到充分探索，其结构-性能关系尚不明确。

可以依次或单独合成嵌段来制备不同疏水性的嵌段共聚物。单独合成每个嵌段可以更好地控制分子量、分散性和共聚物组成，从而影响纳米粒子的自组装形态。聚合物-聚合物偶联是合成复杂聚合物的常用方法。硫醇-烯、硫醇-炔和叠氮化物-炔烃点击化学由于其高产率（65% 至 90%）、总体选择性高、副产物少而特别适用于小分子偶联反应，复杂的聚合物-聚合物偶联反应仍难获得高产率。

嵌段共聚物自组装形态由嵌段比决定。与表面活性剂类似，HBC 纳米结构形态也由两个嵌段的亲水/疏水平衡（HHB）控制。在水性介质中，两亲性 HBC 自组装成各种纳米结构，以最大限度地降低系统的总自由能。核壳胶束因其两亲性核冠结构（疏水核和亲水冠）而被广泛研究作为药物递送载体。亲水壳充当渗透到细胞器的“隐形层”，而疏水核则捕获疏水小分子，如染料、药物。只有当亲水嵌段质量分数≥疏水嵌段质量分数时，才会形成这些结构。与胶束结构相比，囊泡结构为纳米药物提供了更好的机械稳定性。囊泡结构（脂质体、聚合物囊泡和树枝状聚合物囊泡）是双层纳米结构，具有外部和内部亲水壳以及疏水中间层。与胶束相比，囊泡稳定性更高、循环时间更长和有效载荷释放速度更慢。

研究内容

在此研究中，作者合成了由具有 β-D-葡萄糖侧链的聚丙烯酰胺糖聚合物（亲水嵌段）和支链聚乳酸 (PLA)（疏水嵌段）组成的两亲性杂化嵌段共聚物库，如方案 1 所示。HBCs 在水性介质中通过纳米沉淀形成纳米粒子，并通过原子力显微镜 (AFM)、透射电镜 (TEM) 和动态光散射 (DLS) 进行表征。为了验证纳米粒子作为递送载体的潜力利用疏水性姜黄素和亲水性甲基橙作为模型荧光团进行包封。最后，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法和 LIVE/DEAD 细胞染色来评估人胚胎肾细胞（HEK）活力，并将结果与传统的亲水嵌段进行比较。

 

方案1. HBC 的光偶联合成

  

表1. 组成、转化率 (ρ)、分子量 (Mn)、分散度 (Đ)、比折射率增量（dn/dc）和嵌段共聚物命名

  

图1. (A) ASEC-MALLS测量pGlcEAm 21共聚物的分子量。（B）GPC-MALLS测量支链聚乳酸（PLA）的分子量

采用纳米沉淀法，将 HBC 的有机溶液逐滴加到去离子水中，使其自组装形成纳米粒子。使用 AFM（图 2）、TEM和DLS 研究纳米粒子的尺寸和形态（表 2）。疏水含量最高的 Glc 31:69 嵌段共聚物的直径高于其他 HBC。亲水含量最低的嵌段共聚物（Glc 31:69）形成了囊泡，亲水含量较高的嵌段共聚物（Glc 66:34）形成了胶束，这与预期一致。 双层囊泡通常呈现“甜甜圈”形状，中心高度远低于外缘高度。这主要有两个原因：(1) 囊泡可能破裂，释放出其中所含的液体， (2) 即使在轻敲模式下，AFM 探针产生的力也会导致囊泡变形。Glc 38:62 呈现双层囊泡和胶束的混合物，表明 HHB 的过渡范围不利于一种结构的形成。Glc 76:24 因疏水含量不足，无法实现稳定的纳米结构，故对该共聚物未进一步研究。DLS 测量的直径结果要大得多，表明溶液中存在粒子聚集。DLS 粒径分布广，平均直径没有统计学上的显着差异。聚集现象常见，这归因于分子间/内氢键和疏水相互作用。然而，整体聚集可能归因于 HBC 中的糖含量或自组装结构的表面积体积比的差异。

 

图2. AFM 结果：（A）Glc 31:69 自组装成直径约为 120 nm 的球形双层囊泡，(B) Glc 38:62 呈现双层囊泡和胶束的混合物，胶束约为 47 nm，囊泡约为 180 nm，(C) Glc 66:34 呈球形核壳胶束，平均直径为 41 nm和 (D) Glc 76:24 缺乏结构稳定性而产生不规则特征。

  

表2. 通过 AFM、TEM 和 DLS 测量 HBC 在水中形成的纳米粒子的平均直径

pH 对纳米粒子自组装和随时间稳定性的影响对于其在生物医学中的应用非常重要。在pH 1~12 的水溶液中纳米沉淀 Glc 38:62，孵育 24 小时，研究其形态变化。 pH 对纳米结构形态的影响如图 3 所示。酸性条件下产生的 Glc 38:62 纳米粒子直径相较中性条件下有所增加： 47 和 180 nm（pH = 7），77.6 和 425 nm（pH = 1），103 和 438 nm（pH = 3）（图 3A、B 和 C）。这表明高酸性条件可促进含葡萄糖结构的 HBC 发生更高程度的聚集，从而形成更大的纳米粒子。碱性条件下产生的纳米粒子与中性环境中形成的纳米粒子直径相当： 63.7 和 138 nm（pH = 10），69.3 和 145 nm（pH = 12）（图 3D、E）。碱性环境中形成的纳米粒子在监测的 24 小时内表面均匀，强酸性环境中形成的纳米粒子的表面显示出不规则的穿刺孔和凹陷，表明发生了降解。通过比较图 3A/F 和 B/G，纳米粒子在酸性环境中 24 小时后会发生完全降解，在 DLS 中观察到了进一步的降解证据。

 

图3. 自组装和纳米结构的稳定性取决于纳米沉淀的 pH 值

  

图4. 多步染料封装，拟议结构和染料位置

疏水性姜黄素可以封装到由 Glc 31:69 和 Glc 38:62 形成的囊泡的双层壳中，以及由 Glc 66:34 形成的胶束的核心中，图 4A。载有姜黄素的胶束表现出比囊泡更高的 DL % 和 EE %。由 Glc 66:34 产生的胶束具有最高的 DL % 和 EE %，分别为 11.55% 和 23.10%。由 Glc 31:69 产生的囊泡的 DL % 和 EE % 最低，分别为 4.25% 和 8.50%。在没有 HBC 的情况下，姜黄素完全不溶于水，而使用 HBC 可以将姜黄素包裹在纳米颗粒中，然后纳米颗粒会很好地分散在溶液中，从而产生黄色透明溶液。对于我们的系统，我们发现随着亲水链长度的增加，姜黄素染料的 DL % 和 EE % 会增加。文献中也报告了类似的趋势，Dattani 等人表明，囊泡的 DL % 低于胶束，疏水性药物的释放速度也更慢。

Glc 31:69 和 Glc 38:62 形成的纳米结构显示出双层囊泡，在三个不同的位置和亲水分子相互作用：（1）糖聚合物壳的外表面，（2）糖聚合物内表面，（3）内部水袋内，图 4B。表 3 总结了Glc 31:69， Glc 38:62 和 Glc 36:34的 DL % 和 EE % 值。

  

表3. 不同纳米结构对甲基橙和姜黄素染料的负载和包封效率

为了确定 HBC 的细胞毒性，将 HEK293 细胞与 HBC 孵育 24 小时，然后量化释放的 LDH。使用传统的生物相容性亲水性聚合物 PEG 作为阴性对照，使用 Triton X-100 作为阳性对照。如图 5 所示，在所有测定浓度下，PEG 和 HBC 的细胞毒性都很低 (<5%)。在较高浓度下，还通过LIVE/DEAD 细胞染色与 LDH 测定相结合来验证细胞的健康状况，以确保细胞活力和数据的有效性。 LIVE/DEAD 细胞染色后的代表性荧光显微镜图像（图 5）显示，与对照组相比，细胞死亡的迹象很少。这些数据证明了 HBC 可用作药物和染料输送的生物相容性运载载体的潜力。

 

图5. (A) 使用乳酸脱氢酶(LDH)释放法定量分析 HEK 293 细胞在HBC中暴露 24 小时后的细胞毒性。 (B) 和 (C) 使用钙黄绿素-AM 染色活细胞。(D) 和 (E) 使用 BOBO-3 染色死细胞。图像 (B) 和 (D) 为对照，(C) 和 (E) 与 Glc 31:69一起孵育。

结论

       在此研究中，作者通过硫醇-烯光偶联合成了由 β-D-葡萄糖聚合物和支链 PLA 组成的两亲性杂化嵌段共聚物，并研究了它们的自组装形态和染料吸收能力。通过改变亲水性糖聚合物的链长来改变亲水/疏水平衡，以了解其对纳米结构形成的影响。亲水比例为 ∼30% 的 两亲性杂化嵌段共聚物产生双层囊泡，亲水比例为 ∼40% 的两亲性杂化嵌段共聚物产生囊泡和胶束的混合物，亲水比例为 ∼60% 的两亲性杂化嵌段共聚物产生胶束。当亲水比例 >70% 时，观察到不稳定聚集体的形成。亲水比例 30-60% 的稳定纳米粒子表现出不同的递送能力，可有效封装疏水性、亲水性分子。纳米粒子在中性和碱性 pH 下稳定，但在酸性条件下 24 小时内降解。细胞毒性实验表明两亲性杂化嵌段共聚物的毒性低，具有生物相容性和在生物医学应用中的潜力。

图6. 实验所用CEP（CAS：1137725-46-2）来自AmBeed

Doi: 10.1021/acs.biomac.4c00885