AmBeed文献解读| communications biology

结核分枝杆菌L,D-转肽酶2及其天然单体底物的生化和晶体学研究

2024 年 9 月 18 日，英国牛津大学的Christopher J. Schofield课题组在communications biology发表题为《Biochemical and crystallographic studies of l,d-transpeptidase 2 from Mycobacterium tuberculosis with its natural monomer substrate》的研究。研究团队通过肽聚糖球囊的过量产生，优化了一种从Corynebacterium jeikeium细菌细胞壁中分离天然二糖四肽单体的方法。这些分离出的四肽单体被用于进行LdtMt2的结合和转化实验以及生物物理研究。研究者们成功解析了LdtMt2与天然底物结合后的野生型晶体结构，揭示了其在肽聚糖层的四肽单体中的形态。该结构展示了催化性半胱氨酸与供体底物之间形成的硫酯键，这一中间体的形成对于理解转肽酶反应机制至关重要。此外，该结构还阐明了供体底物如何进入LdtMt2的活性位点，为未来设计LdtMt2的抑制剂提供了重要的结构信息。

研究背景

结核病（TB）对全球健康造成了重大影响，但目前用于治疗结核病的药物种类有限。破坏细胞壁的生物合成是目前治疗细菌感染最有效的方法。β-内酰胺类药物是青霉素结合蛋白（PBPs）的高效且安全的抑制剂。Mtb 在固定相期间显示出高达 80% 的 3→3 交联。因此，Ldts 已被确定为开发抗结核治疗的有吸引力的靶标。LdtMt2是结核分枝杆菌中的一种酶，负责催化细胞壁肽聚糖形成3→3交叉链。这种酶在细菌的致病性中起着重要作用，并且是开发新型抗结核药物的有力的靶点。尽管LdtMt2是一个有希望的药物靶点，但对其底物结合方式的了解不足限制了有效抑制剂的开发。

研究内容

图1 糖基转移酶、转肽酶和羧肽酶在细菌肽聚糖合成最后阶段的作用

具有糖基转移酶活性的青霉素结合蛋白（PBPs）将脂质 II 与肽聚糖连接起来，具有羧肽酶活性的 PBPs 将五肽中的肽链切割成四肽，具有转肽酶活性的 PBPs 在五肽链之间形成 4→3 交联。L，D-转肽酶（Ldts）在四肽链之间形成 3→3 交联。3→3交叉链接的产物是通过第三和第四个残基之间的酰胺键与LdtMt2的亲核性半胱氨酸发生共价反应，即Cys354，形成酰基-酶复合物21。然后，四肽链的第二条链的第三个残基与硫酯中间体反应（图B）。

图2 结核分枝杆菌肽聚糖片段的结构。

研究团队通过优化从C. jeikeium细胞壁中分离天然二糖四肽单体的方法，成功获得了高纯度的四肽单体1和2，以及乳酸四肽3。这些单体是通过化学和酶促反应从细菌细胞壁提取并纯化的，为后续的结合和转化实验提供了必需的底物。化合物9合成中的偶联反应涉及材料有树脂、Fmoc- D-iGln-OH、L-Lys、D-iGluNH2和L-Ala。其中实验所用的Fmoc- D-iGln-OH (112898-00-7, A286579) 来自AmBeed品牌。

 

图3 LdtMt2 转肽酶活性的质谱分析

研究人员评估了LdtMt2对不同肽聚糖单体的催化活性，发现LdtMt2能够有效催化四肽单体1、2和3(GlcNAc-MurNAc的肽1，含有GlcNAc-Muramitol的肽2，以及乳酸肽3)形成产物 5、6 和 7，质量分别为 1786 Da、1790 Da 和 974 Da。

 

图4  一种基于荧光的 LdtMt2 转肽酶活性测定法

研究者还开发了一种基于LdtMt2天然底物转化的高通量测定方法，用于评估LdtMt2的活性和潜在的抑制剂。该方法涉及使用D-氨基酸氧化酶和辣根过氧化物酶的耦合反应来检测D-Ala的释放，从而反映LdtMt2的转肽酶活性。

 

图5 LdtMt2 与肽聚糖片段 3 的晶体学研究显示共价硫酯形成

通过X射线晶体学分析，研究人员确定了LdtMt2与四肽单体3复合物的晶体结构，揭示了LdtMt2催化反应中的硫酯中间体。该结构为理解LdtMt2如何与其底物相互作用以及设计新型抑制剂提供了关键信息。

结论 

LdtMt2是结核病治疗的潜在的药物靶标，尽管关于它所催化的转肽酶反应的机制少有报道。作者发现过量生产肽聚糖骨架，可优化从C. jeikeium细菌细胞壁中分离天然二糖四肽单体1-4的方法。作者还通过X射线晶体学研究探索了LdtMt2与分离的四肽单体1和3之间的相互作用，获得了在LdtMt2催化中提出的硫酯中间体的结构。该结构提供了底物进入LdtMt2活性位点的模式以及由它进行的活性位点相互作用的信息，这些综合结果将有助于设计新型LdtMt2抑制剂。

Doi: https://doi.org/10.1038/s42003-024-06785-3