AmBeed文献解读|Nature Chemistry

蛋白质半合成揭示了HECT E3泛素连接酶机制的可塑性

哈佛医学院Haribabu Arthanari和Philip A. Cole课题组，于2024年7月19日，在Nature Chemistry发表题为《Protein semisynthesis reveals plasticity in HECT E3 ubiquitin ligase mechanisms》的文献。

赖氨酸泛素化已成为一种主要的翻译后修饰方式，它控制着蛋白质的稳定性和细胞信号传导途径，并且由E1、E2和E3泛素（Ub）连接酶级联催化。许多E3连接酶被视为癌症和其他疾病的药理学靶点。此外，利用E3连接酶的功能，通过蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）来实现目标蛋白的降解，已成为一种新兴的治疗方法，用于治疗难以通过传统小分子抑制的蛋白质导致的疾病。在大约600种人类E3 Ub连接酶中，HECT（同源于E6AP羧基末端）家族的28个成员，因在疾病发展过程中的重要性，以及它们通过Cys-Ub中间体直接将Ub转移至其蛋白质底物而受到特别关注。例如，首个被鉴定的E3 Ub连接酶——E6AP，是一种HECT酶，它通过泛素化和降解肿瘤抑制因子p53，促进了人乳头瘤病毒的致癌作用。NEDD4亚家族，包括NEDD4和WWP2，参与了肿瘤抑制因子PTEN的调节水平以及自噬过程。

尽管E3连接酶在生物医学上具有重要地位，但它们的催化机制尚不完整。这种催化机制的理解有助于指导研究者们设计合理的抑制剂，并推进PROTACs和分子胶的发现。原则上，由于HECT酶在Ub转移中的直接参与，它们比更大的RING E3 Ub连接酶家族的成员更容易进行机制研究。大约400个氨基酸（aa）的HECT域包含一个C末端催化Cys残基，该残基从E2~Ub硫酯类接收Ub，然后将Ub传递给蛋白质底物的赖氨酸侧链（图3a）。HECT域有一个N末端叶，在某些情况下，该叶可能与E2酶以及蛋白质底物相互作用，还有一个C末端叶，最终形成一段保守的肽序列，该序列已被证明对催化至关重要。在9种人类HECT酶（28种）中，即NEDD4家族，最后一个残基是Asp或Glu，这种残基对突变敏感，被认为是催化碱基（图3b）。然而，由于其他19种HECT酶通常缺乏这种残基，引发了关于NEDD4家族酶中Asp/Glu在机制上作用的不确定性。此外，由于活化酯（如硫酯）和一级胺之间的非酶促酰基转移反应被认为是容易的，目前尚不清楚酶介导的碱/酸催化是否真的是赖氨酸泛素化所必需的。由于HECT催化涉及从E2接收Ub以及将Ub连接到底物赖氨酸，连接N末端和C末端叶的铰链环允许HECT酶在两种不同的构象之间切换——倒T型和L型。大量结构和之前的生化研究表明，倒T型与E2结合，当Ub转移到HECT后，它采用L型将Ub转移到底物上。

在本文中，作者采用蛋白质半合成、化学挽救、微量热泳动（MST）和其他生化方法，系统地研究HECT机制，为碱/酸功能和HECT泛素负载在促进E2从HECT结构域释放提供独特的见解。

图 1. 实验所用Fmoc保护氨基酸来自AmBeed等品牌

图 2. 实验所用Fmoc保护氨基酸列表

图 3. a. E1、E2和HECT家族E3连接酶催化的蛋白泛素化。 b. 人类NEDD4家族HECT E3和其他具有代表性的HECT E3连接酶的序列比对

图 4. NEDD4突变体的化学挽救实验

图 5. HECT酶中C端主链羧酸盐的分析

图 6. 羧酸盐在Rsp5 E3连接酶中的多功能性

图 7. 利用泛素化中间体（E3-Ub或E2-Ub）分析蛋白质-蛋白质相互作用

图 8. HECT E3连接酶的进化分析

结果：

1. C末端天冬氨酸（Asp）在NEDD4催化中的作用，研究结果表明：Asp900在Ub连接酶活性中具有重要性，侧链羧酸盐的功能可能特别关键，进一步研究表明C端侧链羧酸盐的精确位置可能在这个酶家族中尤为重要。半合成的NEDD4蛋白含有一个T893C替代物，它在自体泛素化试验中具有良好的耐受性。通过化学挽救实验，作者发现某些小分子阴离子化合物能够部分恢复突变酶的催化活性，暗示了Asp900在质子转移中的关键作用。

2. 非NEDD4 HECT 酶中的末端羧酸盐，研究结果表明：对比NEDD4与其他非NEDD4 HECT酶，发现非NEDD4 HECT酶需要主链C末端羧酸盐来发挥泛素转移中的酸碱功能。

3. E3泛素化降低了其对E2的亲和力，研究结果表明：Ub与NEDD4和WWP2的结合导致其与UbcH5b的亲和力显著降低（>30倍）。当使用不同的E2（WWP2-Ub与UbcH7）和游离的NEDD4HECT结构域被泛素化（P44和P45）时，亲和力均降低。此外，NEDD4催化Cys共价连接的泛素不会通过参与变构Ub结合位点而影响E2的亲和力。E3泛素化会选择性地削弱E2相互作用，而不是蛋白质底物相互作用。作者推测，对于整个HECT家族，Ub从E2转移到HECT蛋白的Cys上，会引起构象变化，从而减弱E2的结合，但有利于与蛋白质底物的结合。

4. NEDD4泛素化促进了T到L的构象转变，研究结果表明：NEDD4-Ub突变形式与E2的结合比WT NEDD4-Ub更紧密，此外，作者设计不稳定突变的L型大大降低了NEDD4的催化活性，最能体现NEDD4-Ub的液态构象，与其他HECT酶的构象一致（泛素化的E2与HECT T型结合，在将Ub传递给HECT后，HECT-Ub形成L型）。通过氟谱检测NEDD4-Ub的构象，发现泛素化导致Phe896变得更为刚性而受到保护。

结论：

作者证明了在HECT E3泛素连接反应中，末端侧链或主链羧酸盐在质子转移上具有可塑性，酵母Rsp5直系同源物可能是进化中间体。此外，作者还发现了HECT结构域的泛素共价中间体似乎会解离出E2结合酶，从而促进催化转化。这些结果为理解蛋白质泛素化如何发生，提供了关键的机制见解，并为理解E3的功能和调控提供了一个框架。

文献DOI：10.1038/s41557-024-01576-z